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如何在電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)做體外細(xì)胞培養(yǎng)

更新時(shí)間:2022-03-30  |  點(diǎn)擊率:1095

       細(xì)胞培養(yǎng)是生物醫(yī)學(xué)研究人員必須掌握的一項(xiàng)基本技能,是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。所以,了解細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作要領(lǐng),對(duì)生物醫(yī)藥科研工作者,特別是對(duì)基礎(chǔ)研究工作者來(lái)說(shuō),顯得尤為重要。喆圖小編從實(shí)際操作的角度談?wù)勼w外細(xì)胞培養(yǎng)操作要點(diǎn)。

   一、試驗(yàn)前的準(zhǔn)備

   一般細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境為5%的二氧化碳,37℃恒溫及飽和濕度。在細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)始之前,實(shí)驗(yàn)人員必須查閱資料,了解細(xì)胞培養(yǎng)的習(xí)慣,如貼壁、半貼壁、懸浮物等。理解細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件,大多數(shù)細(xì)胞為10%胎牛血清+89%培養(yǎng)液+1%抗生素。培養(yǎng)基的種類當(dāng)然很多,高糖、低糖、分化培養(yǎng)基、干細(xì)胞培養(yǎng)基等等。依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)條件,預(yù)選適宜的消耗材料,如促貼壁或低吸附培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行處理前,計(jì)算出這次處理所需的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基總量,并將生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行配比。

   二、細(xì)胞消化

   與懸浮細(xì)胞相比,貼壁細(xì)胞的傳代步驟較多,應(yīng)避免不必要的細(xì)胞污染。傳代操作可以在細(xì)胞生長(zhǎng)集中程度達(dá)到80-90%左右的時(shí)候進(jìn)行。由于細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度依賴關(guān)系,過(guò)或過(guò)早傳代都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)。取細(xì)胞培養(yǎng)盒, PBS清洗2次。此時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的液體吸凈,可采用真空泵、移液管、一次性吸管等,但無(wú)論采用何種吸凈方法,均應(yīng)避免操作手觸碰瓶口而造成污染,吸頭觸碰細(xì)胞面而造成細(xì)胞機(jī)械損傷。將液體吸凈,加入適量胰蛋白酶。胰酶不宜過(guò)多,只需少量滴在培養(yǎng)瓶上,傾斜培養(yǎng)可使細(xì)胞面覆蓋。細(xì)胞可以在這個(gè)時(shí)候放置在電熱恒溫培養(yǎng)箱里,37℃條件下有利于胰蛋白酶的消化。大約2分鐘就可以消化了。自然地,有些細(xì)胞更容易消化,可能消化過(guò)程只需要30秒,如TC-1、MC-38等腫瘤細(xì)胞株;另一些則消化得更慢,如培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。

   如何判斷細(xì)胞消化過(guò)程是否已經(jīng)結(jié)束?在倒置顯微鏡下我們可以看到細(xì)胞的形態(tài),大多數(shù)的細(xì)胞由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)槁褕A形,可見(jiàn)細(xì)胞浮通過(guò)肉眼還可以直接觀察到細(xì)胞面從光滑到毛玻璃狀的變化。此可加入適量*的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化,基本上可加3-5毫升。加水輕輕吹吸后移至離心管進(jìn)行離心,基本可將離心1000轉(zhuǎn)離心3分鐘即可分離細(xì)胞,轉(zhuǎn)速不宜過(guò)高,否則細(xì)胞碎片會(huì)隨離心下墜。離心性反應(yīng)后棄上清液。此時(shí)可直接倒入,然后用移液槍清洗殘余液體。

   3.接種

   對(duì)上述細(xì)胞沉淀物進(jìn)行重懸??山柚谛郎u震蕩儀進(jìn)行重懸,也可在重懸細(xì)胞前用手指輕彈離心管底部,再加入適量的培養(yǎng)基重懸,切忌直接加入培養(yǎng)基后用移液槍吹干。在2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中,將重懸好的細(xì)胞全部分離,補(bǔ)全生長(zhǎng)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。約8-10毫升的培養(yǎng)液用于T25培養(yǎng),20-25毫升的培養(yǎng)液用于T75培養(yǎng)。注射后,十字混勻,每日鏡下觀察細(xì)胞狀況。傳代比例可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行調(diào)節(jié),如快速生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞株,可按1:5甚至1:10的比例進(jìn)行傳代。但原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)較慢,可在1:2甚至2:3傳代。


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